11 июня 2012

Природа эндогенного продукта

«Ранний» (на 20-й минуте реакции) эндогенный продукт, как показал его анализ, представляет собой ДНК, ассоциированную с 60 — 70S-вирионной РНК. С помощью обработки ферментами и равновесного центрифугирования в градиенте плотности Cs2SO4 установлено, что основная 8 — 10S-фракция на 12-й минуте реакции содержала примерно равное количество односпиральной ДНК (в зоне с плотностью 1,42 — 1,44 г/мл, характерной для ДНК), меньше двуспиральной ДНК и ДНК — РНК-гибрида (в зоне с плотностью 1,55 г/мл, которая характерна для гибридов).

Среди этих компонентов находились и такие, плавучая плотность которых составляла 1,66 г/мл, что характерно для РНК. При отжиге эндогенного ДНК-продукта с вирионной РНК часть радиоактивной ДНК определялась как в зоне с плотностью, равной 1,66 г/мл, т. е. характерной для РНК, так и в зоне, характерной для ДНК — РНК-гибридов.

На 20-й минуте синтеза эндогенный ДНК-продукт с константой седиментации 8 — 10S содержал больше односпиральной ДНК, меньше двуспиральной ДНК и несколько больше гибрида. Поскольку 10S-фракция дает один пик в градиенте плотности CS2SO4 между пиками односпиральных и двуспиральных ДНК-маркеров, предполагают, что продукты ДНК (односпиральные и двуспиральные) связаны друг с другом.

Основная масса эндогенного ДНК-продукта на 60-й минуте реакции (т. е. в период длительного синтеза) состоит из двуспиральной ДНК с той же константой седиментации. Последнее обстоятельство свидетельствует о том, что в процессе синтеза не происходит удлинения синтезируемой ДНК.

Таким образом, эндогенный ДНК-продукт как на ранних, так и на поздних этапах синтеза представлен тремя компонентами: гибридами ДНК — РНК, односпиральными и двуспиральными ДНК, причем на ранних стадиях доминируют первые два типа продуктов, а на поздних — двуспиральная ДНК.

Важно подчеркнуть, что при синтезе in vitro эта двуспиральная ДНК имеет весьма малые размеры 8 — 10S-компонентов, что соответствует молекулярной массе 80 000 — 100 000. После того как в клетках, зараженных онкорнавирусами, были обнаружены двуспиральные ДНК с молекулярной массой 5,5 — 6,6Х106, представляющие собой полные копии вирусного генома, предположение о дефектности синтеза in vitro стало более вероятным (Gianni et al., 1976; Ramareddy et al., 1976).

He исключено, что в клетке процесс полной и непрерывной транскрипции обусловливается определенными клеточными компонентами.

Синтез же двуспиральных ДНК малых размеров in vitro можно объяснить следующими признаками:

  1. дефектностью системы, в которой используемые условия реакции не являются оптимальными, 
  2. деградация синтезируемой ДНК может осуществляться нуклеазами, присутствующими в препаратах вируса,
  3. вполне возможно, что в клетке синтезируемые короткие 8 — 10S ДНК-фрагменты сшиваются ДНК-лигазой в полный ДНК-провирус. Collett и Faras (1977) показали, что ДНК-продукт, синтезированный на реконструированном комплексе 35S РНК — три-тРНК или на 70S РНК в присутствии низких концентраций дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), состоит из дискретной популяции молекул, ни одна из которых не превышает по длине 2000 нуклеотидов.

ДНК-транскрипты более 2000 нуклеотидов удавалось синтезировать как на 70S РНК, так и на реконструированном комплексе путем увеличения концентрации дНТФ.

ДНК, синтезируемые AMV, разрушенным детергентом, оказались значительно длиннее (до 5000 нуклеотидов), чем ДНК, синтез которых осуществлялся в реконструированном комплексе с помощью очищенной ревертазы AMV.

Последние данные свидетельствуют о том, что для полной транскрипции вирусного генома существенное значение могут иметь либо вторичные структурные отличия между матрицами в разрушенном вирусе и реконструированном комплексе, либо наличие в системе каких-то вирионных компонентов.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…