11 июня 2012

Механизмы реакции

Для обратной транскриптазы, как и всякого фермента, осуществляющего полимеризацию нуклеотидов, требуется наличие в полимеразной смеси компонентов, из которых прежде всего необходима матрица. В данной системе различают три типа матриц.

Первый тип
— эндогенная матрица.

Этот термин применяют только тогда, когда в качестве матрицы используют вирионную высокомолекулярную РНК, а в качестве фермента — разрушенный онкорнавирус.

Второй тип
— экзогенная синтетическая матрица

Данный термин употребляют только по отношению к синтетическим рибо-или дезоксирибополимерам (например, поли-рА или поли-дА) или гибридным синтетическим комплексам типа поли-рА: поли-дТ, которые могут функционировать в качестве матриц как в системе разрушенного вируса, так и в системе очищенного фермента.

Третий тип — природная экзогенная матрица

Этот термин используют в отношении индивидуальных мРНК, которые в основном транскрибируются в системе с очищенным ферментом.

Вторым необходимым компонентом в полимеразной реакции является затравка, выполняющая инициирующие функции в синтезе ДНК на матрицах ДНК и РНК. Затравка представляет собой короткий полинуклеотидный фрагмент, содержащий 75 нуклеотидов, который инициирует синтез ДНК путем ковалентного присоединения к себе полимеризующихся дезоксинуклеотидов.

На 5´-конце затравки идентифицирован рд, на 3´-конце — СрСрАон.

В молекулах затравки имеется определенное число минорных нуклеотидов, характерных для тРНК. Однако в противоположность большинству тРНК в РНК-затравке отсутствует r-Тр и обнаружен Gp (ΨpΨpCp)Gp. По-видимому, эта последовательность замещает типичную последовательность GprTpΨpCpGp.

В случае эндогенного синтеза ДНК функцию затравки, вероятно, выполняют низкомолекулярные природные 4S тРНК, ассоциированные с вирионной 60 — 70S РНК, а в системе с очищенным ферментом — олигонуклеотиды типа олиго — дГ. Как минимум 50% 4S тРНК, способной функционировать в качестве затравки, используется в стандартной полимеразной реакции in vitro (Dahlberg et al., 1974; Taylor, 1977).

Установлено сродство три-тРНК к высокоочищенной обратной транскриптазе AMV, которое настолько велико, что позволяет таким способом извлечь три-тРНК из смеси клеточных тРНК, выделенных из фибробластов куриного эмбриона.

Помимо три-тРНК, с ревертазой связывается также мет-тРНК. При связывании изменяются седиментационные свойства обратной транскриптазы, что свидетельствует о связывании три-тРНК с самим ферментом, а не с возможной примесью.

Обработка ревертазы моноспецифическими антителами к обратной транскриптазе предотвращает связывание три-тРНК, а также блокирует ДНК-полимеразную активность.

По-видимому, способность фермента использовать три-тРНК. в качестве затравки для синтеза вирусной ДНК обусловлена тем, что на молекуле обратной транскриптазы есть высокоизбирательный участок для связывания затравки — три-тРНК.

Получены данные, позволяющие считать, что на РНК AMV имеются два типа участков связывания с ревертазой: неактивные, только связывающие фермент, и активные, на которых и синтезируется ДНК (Yamaura, Cavalieri, 1976).

Учитывая седиментационные характеристики ревертазы при различных ионных силах, можно предполагать, что неактивные участки образуются тогда, когда обратная транскриптаза находится в димерной форме.

В случае высоких концентраций ревертазы, при которых фермент находится в мономерной форме, полимераза неактивна по отношению к РНК AMV при ионной силе 0,4, но сохраняет активность в связывании с синтетической матрицей поли-рА: олиго-дТ.

Показано, что участки неактивного связывания не ассоциируются с отдельными разрывами в молекуле РНК или с частичной денатурацией молекулы РНК и, вероятно, каким-то образом взаимодействуют с «неправильными» молекулами 4S тРНК-затравки.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…