8 июня 2012

Детекция неинфекционных фрагментов ДНК

Проведена детекция неинфекционных фрагментов ДНК из клеток, зараженных вирусом лейкоза птиц, с помощью спасения маркера.

Этот метод оказался менее эффективным, чем тест на инфекционную ДНК RSV (Cooper, Castellot, 1977). Установлено, что генетические маркеры для ДНК-полимеразы (pol) и оболочки (env) связаны и локализованы на одном и том же Е. coli RI-фрагменте ДНК из зараженных RSV-клеток.

Успешно была осуществлена трансфекция ДНК из мышиных клеток, зараженных экотропными (N, В и NB) онкорнавирусами лейкоза мышей (Hsu, Yang, 1977). Наибольшей активностью обладала ДНК с молекулярной массой 25Х106. Чувствительность различных мышиных клеток к трансформации не коррелировала с их чувствительностью к инфекции вирусом.

Вирионы, выделяемые клеткой после трансфекции, обладали способностью к инфекции клеток той же тропности, что и исходный родительский штамм.

В настоящее время используют три основных метода для обнаружения вирусспецифической ДНК в клетках, зараженных и трансформированных онкорнавирусами. Первый из них основан на гибридизации клеточной ДНК с двунитевым 3Н-ДНК-продуктом, синтезированным in vitro на вирусной 70S-матрице.

Существенным преимуществом этого метода является возможность определения числа копий вирусного генома при использовании сравнительно небольшого количества ДНК клетки. Высокая чувствительность метода позволяет выявлять до 0,5 копий на гаплоидный геном.

Применение метода ограничивает то, что синтезируемый ДНК-продукт, как правило, представляет собой копию лишь части вирусного генома. Детекцию образующихся гибридов проводят либо хроматографией на гидроксилапатите, либо с помощью нуклеазы SI, специфичной для однонитевых полинуклеотидов.

Принцип второго метода основан на гибридизации клеточной ДНК с однонитевым 3Н-ДНК-продуктом, синтезированным в присутствии актиномицина D, с вирусной 70S РНК (минус-нить, содержащая практически все последовательности нуклеотидов, входящие в вирусный геном).

Этот феномен обусловлен не увеличением протяженности транскрибирующих участков РНК в присутствии актиномицина D, а тем, что этот препарат ингибирует синтез плюснитей ДНК и способствует, таким образом, накоплению в системе транскрибирующихся минус-нитей ДНК, комплементарных вирионной РНК. Данный метод позволяет обнаруживать в составе ДНК два типа последовательностей: повторяющиеся и уникальные.

Полная реассоциация зависит от значительного избытка соответствующих последовательностей в клеточной ДНК.

В связи с тем что синтезируемая in vitro ДНК гетерогенна по размеру, не синхронно транскрибируется с матрицы и обнаруживается в незначительном количестве копий на клеточный геном, не удается достигать уровня гибридизации выше 60 — 70%. Это, естественно, создает определенные трудности для точного измерения числа вирусных копий в геноме клетки.

Наконец, третий метод является наиболее прямым, поскольку он связан с гибридизацией высокомолекулярной меченой 60 — 70S РНК с клеточной ДНК, обработанной ультразвуком. При этом варианте благодаря тому, что происходит конкуренция между меченой вирионной РНК и одной из нитей ДНК клетки, немеченая ДНК должна присутствовать в значительном избытке. Основной недостаток метода заключается в возможности деградации РНК при гибридизации. Температура плавления образующихся гибридов (ДНК — ДНК и ДНК — РНК) может служить индикатором комплементарного спаривания. Для определения вирусных ДНК-копий пользуются также сравнительно простой процедурой.

Основана она на том, что если осуществлять ренатурацию неозвученной ДНК клетки при низких значениях C0t, при которых реассоциируют повторяющиеся, но не уникальные последовательности, то образуются агрегаты ДНК вследствие возникновения водородных связей между множественными повторяющимися последовательностями каждой нити.

Такие сетчатые структуры из раствора удаляют центрифугированием и тестируют на наличие в них вирусспецифической ДНК.

К настоящему времени накопилось достаточно данных, свидетельствующих о приемлемости всех указанных методов для обнаружения вирусспецифической ДНК в клеточном геноме.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…