6 июня 2012

Кинетика заражения куриных фибробластов инфекционными ДНК

Кинетика заражения куриных фибробластов инфекционными ДНК, выделенными из клеток, инфицированных RSV и REV, отражается одноударной кривой, т. е. вирусная ДНК интегрирует с клеточным геномом как одна целостная единица. В случае RSV инфекционность оценивали по фокусобразующей способности, а в случае REV — по цитопатогенному действию.

Показана независимая сегрегация двух вирусных геномов при одновременном заражении клеток RSV и REV (Cooper, Temin, 1974). Инфекционность при трансфекции наблюдалась при использовании ДНК из клеток, зараженных RSV в количестве 0,12 мкг, и 0,08 мкг для ДНК из клеток, инфицированных REV. Указанные количества клеточной ДНК были инфекционными, если фибробласты кур предварительно обрабатывали ДЭАЭ-декетраном (50 мкг/мл).

Если же обработка не производилась, то минимальное количество ДНК составляло 5 мкг. Сходные уровни инфекционности были получены при использовании ДНК из различных клеток — зараженных и трансформированных, как вируспродуцирующих, так и непродуцирующих. Инфекционность отсутствовала, если использовали ДНК из незараженных клеток.

Клетки уток и фазанов оказались чувствительными к трансфекции ДНК из куриных клеток, зараженных RSV и REV. ДНК из клеток, инфицированных RSV, с молекулярной массой 9Х106 и выше полностью сохраняет инфекционность, характерную для высокомолекулярной ДНК, в то время как ДНК с молекулярной массой 6Х106 и 5Х106 — лишь 20% и 5% инфекционности необработанной ДНК.

На основании этих данных считают, что масса инфекционной ДНК, содержащей всю генетическую информацию, необходимую для продукции RSV, для этой системы составляет 6Х106. Для ДНК из клеток, зараженных REV, минимальная масса инфекционной ДНК равна 10 — 20Х106. Инфекционность вирусспецифической ДНК соответствует одной инфекционной единице на вирусную ДНК с молекулярной массой 105 — 106.

Для выделения вирусной РНК после интеграции с клеточной хромосомальной ДНК необходим фермент, гидролизующий только клеточную ДНК и не затрагивающий вирусную ДНК.

Показано, что рестриктаза из Anabaena variabilis (Ava I) удовлетворяет этим требованиям. Трансфекция ДНК (5 мкг) из клона клеток, полученных из единственного фибробласта эмбриона цыпленка, трансформированного RSV штамма Шмидта — Руппина субгруппа D (RS — D RSV), постоянно сопровождалась продукцией недефектного RSV (Kopecka et al., 1976).

Эта ДНК названа ndSR — DRSV. ДНК, экстрагированная из всей культуры фибробластов цыплят, трансформированных тем же вирусом, после трансфекции, давала начало как недефектному вирусу, так и вирусу, дефектному в отношении трансфекции, обозначена nd, td SR — D RSV.

Опыты по трансфекции показали, что в SR — D RSV ДНК есть специфические участки, которые узнают следующие рестриктазы: Hind II, Hind III, Hae III, Hpa I, Hpa II, Е. coli RI и Ava II. Рестриктаза Ava I не гидролизует ни nd, ни td SR — D RSV ДНК.

Таким образом, экспрессия ДНК-провируса в реципиентных клетках, с одной стороны, определяется их компетентностью (gs+ и chf+), а с другой — объемом генетической информации трансформирующего вируса, ассоциированной с ДНК опухолевой или инфицированной клетки.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…