6 июня 2012

Фиксации вирусного генома в клеточном

Правомочность предполагаемой схемы первого этапа трансформации (фиксации вирусного генома в клеточном) подтверждается следующими фактами.

  1. Синтез вирусной РНК блокируется актиномицином D, при этом синтез белка продолжается как минимум 2 ч и блока в сборке вирионов не происходит.
  2. В клетках, зараженных онкорнавирусами, не удалось обнаружить нити РНК, комплементарной вирионной РНК.
  3. Осуществляются синтез вирусных ДНК-копий и их функционирование.
  4. Инфекция онкорнавирусами сопровождается стимуляцией синтеза клеточной ДНК и активацией ферментов ДНК-комплекса.
  5. Ингибиторы синтеза клеточных ДНК, блокирующие матричные функции этих ДНК и синтез ферментов ДНК-комплекса, препятствуют также репликаций онкорнавирусов и опухолевой трансформации, индуцированной ими, в частности, встраиванию вирусной ДНК в клеточную.
  6. Вирионы онкорнавирусов содержат все необходимые ферменты, которые могут обеспечивать, с одной стороны, репликацию ДНК, а с другой — рекомбинации, репарации и интеграцию вирусной ДНК с клеточной.
  7. В нормальных, пермиссивных клетках почти всех видов птиц методами молекулярной гибридизации выявлено от 1,7 до 4,6 копий вирусного генома, а в нормальных клетках всех высоко- и низкораковых линий мышей — от 9,5 до 13,8 эквивалента вирусной ДНК на клетку. Инфекция и трансформация нормальных куриных клеток RSV приводят к интеграции новых вирусных последовательностей в клеточную ДНК, что тестируется по увеличению количества меченого ДНК-продукта, реассоциирующегося с ДНК из трансформированных клеток. Количество вирусной ДНК в геноме клетки возрастает в 3 — 4 раза. Причем не удалось выявить увеличения числа копий вирусспецифических последовательностей в клетках после трансформации. В нормальных клетках млекопитающих геном онкорнавирусов птиц отсутствует, в вирогенных клетках их количество составляет 2 — 4 генома на клетку.
  8. ДНК, изолированные из клеток млекопитающих, трансформированных RSV или другими онкорнавирусами, является инфекционной и индуцирует при внесении в чувствительные клетки образование соответствующего вируса, представляющего собой копию исходного вируса. Аналогичные данные были получены на системах MSV и MuLV (Khoury, Hanafusa, 1976; Var-mus et al„ 1976; Svoboda et al., 1975, 1977).

Интересно, что феномен трансфекции не проявляется, когда используется ДНК из нормальных куриных клеток, в которых тем не менее находится несколько копий вирусного генома. Высокомолекулярная ДНК (с молекулярной массой 60 — 100*106) из крысиных ХС-клеток, трансформированных RSV, также не обладала трансфецирующим действием, но приобретала активность после гидродинамической деградации до фрагментов с молекулярной массой 6 — 10*106. Обработка ДНКазой и термическая денатурация полностью устраняли трансфецирующую активность ДНК ХС-клеток.

Вероятно, ДНК-провирус RSV из ХС-клеток дефектен, так как его экспрессия в реципиентных клетках зависела от gs-антигена, т. е. проявлялась в gs+-клетках или в клетках, содержащих chf-фактор (chick cell-associated helper factor).

В то же время ДНК-провирус RSV из вируспродуцирующих клеток, как правило, содержал полную генетическую информацию, экспрессия которой не зависела от chf-фактора и gs-антигена.

Такой ДНК-провирус RSV, внесенный в чувствительные реципиентные клетки, индуцировал их трансформацию и продукцию полного инфекционного вируса (Hill et al., 1975; Svoboda et al., 1975; 1977).

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…