4 июня 2012

Исследования природы РНК-затравки в ДНК-полимеразной реакции

Для исследования природы РНК-затравки в ДНК-полимеразной реакции использовали ее «нагрузку» мечеными олигодезоксинуклеотидами.

Транскрипция 70S РНК RSV ревертазой вириона инициируется последовательностью фд Афд Афд Т…. Дальнейшую транскрипцию можно остановить перенесением в систему, в которой ТТФ замещен на ара УТФ. В этом случае продукт синтеза содержит последовательности фдА, ФдАФдА и ФдАфдАфараУ, все ковалентно связанные с 3´-концевым аденозином молекулы 4S РНК-затравки.

Если синтез происходит в присутствии меченого дАТФ, то эти укороченные нити ДНК «нагружают» только молекулу РНК-затравки, практически не изменяя ее свойств и не затрагивая других молекул низкомолекулярных фракций РНК (Dahlberg et al., 1974; Faras et al, 1974; Taylor, 1977).

Такая «нагруженная» 4S РНК затравка ассоциирована с 70S РНК-матрицей. 4S РНК остается связанной с 355-субъединицами при нагревании до температуры 65 °С, при которой 70S РНК диссоциирует на 35S-фрагменты.

При более высоких температурах (80 °С) «нагруженная» затравка освобождается из субъединиц и при электрофорезе в полиакриламидном геле мигрирует как 4S РНК. При нагревании до 65 °С субъединицы сохраняют матричную активность, а до 80 °С ее теряют. Это указывает на то, что «нагруженная» РНК действительно выполняет функцию затравки. При двумерном электрофорезе 4S РНК разделяется на значительное число фракций, в каждой из которых имеются дискретные виды РНК.

Например, в вирионе RSV присутствует по крайней мере 12 — 15 разных видов 4S РНК. Основное отличие заключается в том, что 80 °C-4S РНК содержит компонент (пятно 1), отсутствующие в 65 °C-4S РНК- Именно РНК из пятна 1 является затравкой как ДНК-полимеразной реакции, направляемой разрушенными вирионами онкорнавирусов, так и очищенным ферментом. Количество этой РНК составляет 15 — 30% тотальной 4S РНК, ассоциированной с 70S РНК, т. е. 3 — 4 молекулы РНК затравки на один вирусный геном.

При анализе структуры пятна 1 выяснилось, что оно соответствует структуре клеточной триптофановой (три) тРНК и содержит антикодон Cm — С — А — , комплементарный кодону для триптофана.

В этой РНК обнаружены необычные последовательности — CΨ — Ψ — С вместо — G — Т — Ψ — С — и m7V — С — вместо 7m7G — U — . Исследование акцепторной функции этой тРНК показало, что она в основном акцептирует триптофан и в совершенно незначительном количестве метионин (Folk, Faras, 1976).

Следовательно, можно считать окончательно установленным, что инициирующие функции в синтезе ДНК у онкорнавирусов птиц выполняет три-тРНК. Получено доказательство необходимости интактных 3´-ОН-концов три- тРНК для инициации синтеза ДНК. Три-тРНК их тотальных препаратов, тРНК клеток цыплят и плаценты человека были одинаково активны в инициации синтеза ДНК.

Предполагают, что в клетках цыплят содержится только одна три-тРНК, эта РНК включается в вирионы RSV и используется в качестве затравки при РНК-направленном синтезе ДНК.

Действительно, после инкубации меченой 4S РНК, изолированной из клеток куриных эмбрионов, с очищенной 35S РНК AMV в условиях, способствующих гибридизации, и при последующем центрифугировании смеси в градиенте плотности сахарозы фракция 4S-PHK седиментирует в области 35S РНК AMV. Основным компонентом, гибридизирующимся с 35S РНК AMV в системе in vitro оказалась три-тРНК. Гибрид, состоящий из очищенной три-тРНК и 35S РНК AMV, является эффективной матрицей, затравкой для синтеза ДНК, катализируемого ревертазой AMV (Waters et al., 1975; Taylor, 1977).

Помимо три-45-тРНК, обнаружены лизиновые (лиз) 4S-TPHK, ассоциированные с 70S РНК AMV. Подсчитано, что на одну молекулу 70S РНК приходится 1,2 — 1,7 молекулы лиз-тРНК (Carlson et al., 1976). В составе вириона не выявлено преобладания лиз-тРНК, которая превалирует в делящихся клетках.

Показано, что в вирионах М — MSV также имеется три-тРНК, однако она, по-видимому, не связана с вирусной РНК (Even et al., 1976). Установлено, что с вирионной 60 — 70S РНК вируса лейкоза Молони ассоциируется широкий спектр тРНК, причем ни один из их видов не является преобладающим (Peters et al., 1977).

Спектр тРНК, ассоциированных с 60 — 70S РНК М — MuLV отличен от такового у RSV. В составе вирионной тРНК не выявлено каких-либо специфических компонентов, однако обнаружен один вид тРНК, которая диссоциирует только после нагревания 60 — 70S РНК М — MuLV до 95 °С, в то время как основная масса тРНК диссоциирует при значительно более низких температурах. Этот вид тРНК имеет клеточное происхождение и является затравкой для ревертазы.

На основании данных анализа аминоакцепторной активности и нуклеотидной последовательности эта тРНК идентифицирована как пролиновая (про)тРНК

Таким образом, участие «связанных» низкомолекулярных РНК в ДНК-полимеразной реакции можно считать доказанным. Установлена их большая роль в процессе транскрипции РНК в ДНК.

Оказалось, что, если 60 — 70S РНК способны транскрибироваться в ДНК, то очищенные субъединицы 30 — 40S РНК транскрибируются только в присутствии молекул 4S РНК, стимулирующих этот синтез.

«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…