23 мая 2012

Исследования Bader и Ray

Bader и Ray (1976), исследовав РНК MuLV, RSV и вируса RD114, пришли к заключению, что их результаты не противоречат предположению о наличии двух субъединиц в состав 70S РНК.

Вместе с тем эти данные позволили предложить мономерную модель, в которой как исходная 70S РНК, так и промежуточные и конечные продукты ее денатурации представляют собой конфигурационные варианты одной и той же молекулы.

До сих пор остается неясной биологическая целесообразность «созревания» 60 — 70S РНК из 30 — 40S-cyб-единиц, являющихся предшественниками высокомолекулярной РНК. Показано, что РНК из вирионов «быстрого урожая» (через несколько часов после выхода) представлена в основном 35 — 375-субъединицами, а РНК из популяции вирионов при длительной инкубации в среде состоит из 70S РНК. Предполагают, что этот процесс формирования в вирионе высокомолекулярной 60 — 70S РНК осуществляется какими-то ферментными системами вирусной частицы.

Интересно, что в непермиссивных условиях и при хронической инфекции в ряде клеточных систем выявлены минимальные формы онкорнавирусов типов А и С (А. Ф. Быковский и др., 1977). Выделенные 6 типов этих форм имеют типичную для онкорнавирусов морфологию и отличаются от них необычайно малыми размерами (их величина 25 — 70 нм, диаметр нуклеотида 10 — 30 нм) и тем, что они включают в вирион только одну субъединицу 30 — 40S РНК или ее отдельные фрагменты.

Патогенные свойства минимальных форм онкорнавирусов пока не доказанн и их биологическая роль до настоящего времени не выяснена.

Итак, с обнаружением нескольких фрагментов в составе вирусного генома сразу же возникло много принципиально новых вопросов, среди которых основным был вопрос о химической и биологической идентичности субъединиц 30 — 40S РНК.

Одним из подходов к исследованию химической однородности субъединиц явилось интенсивно проводимое изучение концевых последовательностей РНК.

Schwartz и соавт. (1977) определили последовательности 20 нуклеотидов в РНК RSV, прилегающих к поли-А-фрагменту на 3´-конце, путем идентификации дезоксинуклеозид-трифосфата, дискриминирующего начало и продолжение обратнотранскриптазной реакции, осуществляемой на матрице вирусной РНК.
Обнаружено, что популяция молекул вирусной РНК состоит из молекул трех типов (если иметь в виду 3´-концевую последовательность нуклеотидов). Различия между молекулами заключаются в последовательностях, непосредственно прилегающих к З´-концу, более удаленные участки у этих молекул оказались одинаковыми.

Первичная структура указанных молекул вирусной РНК формируется следующими последовательностями:

…Г-Ц-Ц-А-У-У-У-У-А-Ц-Ц-А-У-У-Ц-А-поли (А)3´;

…Г-Ц-Ц-А-У-У-У-У-А-Ц-Ц-А-У-У-Ц-А-Ц-Ц-А-поли (А)3´;

…Г-Ц-Ц-А-У-У-У-У-А-Ц-Ц-А-У-У-Ц-А-Ц-Ц-А-Ц-А-поли (А)3´.

В присутствии эндогенной затравки (тРНК-трн), локализованной у 5´-конца вирусного генома, синтезируется ДНК-продукт (strong-stop ДНК), ковалентно связанный с тРНК, длина которого от затравки до 5´-конца матрицы составляет 101 нуклеотид (Haseltine et al., 1977).

После секвенсирования strong-stop ДНК стала известна последовательность 101 основания 5´-конца генома RSV штамм Прага, субгруппа С.

При сопоставлении нуклеотидных последовательностей 3´- и 5´-концов молекулы РНК оказалось, что по крайней мере первые 20 нуклеотидов идентичны последним 20 нуклеотидам и, следовательно, геном RSV имеет на концах повторяющийся участок. Аналогичные данные получены и в отношении вируса миелобластоза птиц (Stoll et al., 1977).

Наличие таких повторяющихся последовательностей делает возможной элонгацию ДНК-продукта по достижении 5´-конца матрицы вследствие образования водородных связей между strong-stop ДНК и комплементарной последовательностью на З´-конце РНК, т. е. циркуляризации молекулы после синтеза strong-stop ДНК и последующего «перескока» ДНК с 5´- к З´-концу молекулы матрицы. Электронно-микроскопические данные, главным образом для онкорнавирусов приматов, свидетельствуют о том, что две субъединицы РНК связаны друг с другом по 5´-концам.

Учитывая установленную нуклеотидную последовательность 3´ и 5´-концов РНК RSV и AMV, предложены две гипотетические модели образования димеров при взаимодействии 5´-концов двух молекул РНК.

Итак, показано, что 5´- и З´-концы генома онкорнавирусов птиц, исключая «закрывающие» структуры — «кэпы» у 5´-конца и поли-А-сегменты у З´-конца, содержат идентичные последовательности длиной в 20 — 21 нуклеотид.

У многих онкорнавирусов определены «кэпы», например, идентифицирован специфический терминальный фрагмент на 5´-конце 35S РНК RSV и MuLV (штамм Молони). Этот фрагмент устойчив к действию нуклеазы, имеет структуру, состоящую из 5´-нуклеозидтрифосфата и рибозы, метилированной в 2´-положении.

К рибозе присоединяется 7-метилгуанозин в 5´-положении через 5´-5´-пирофосфатную связь (7 mG5. ррр5. GmpCp) (Rose et al., 1976).

Второй подход к изучению однородности субъединиц вирусного генома связан с исследованиями поли-А-фрагментов в его составе.


«Механизмы вирусного онкогенеза»,
А.И.Агеенко



Количественные определения в опытах с использованием импульсной метки, а также данные, полученные с ингибиторами белкового синтеза и канаванином, говорят о том, что протеолитическое расщепление Рrlа + b является первым путем образования промежуточных предшественников обратной транскриптазы — PrRTl, 2 и 3. Вместе с тем неясно, играет ли какую-то роль этот путь расщепления в образовании продуктов gag-гена….

Определен полный аминокислотный состав р30 вирусов С-типа мышей, кошек, крыс и обезьян, свидетельствующий о сходстве этих белков по этому критерию. Белок р30 богат остатками аминокислот с полярными боковыми цепями (лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты или их амиды), беден цистеином, метионином, гистидином и изолейцином. Исследование первых 30 остатков с NН2-конца р30 показало высокий уровень родства…

Основная масса вирусспецифических полипептидов синтезируется на мембраносвязанных полирибосомах, а часть находится во фракции свободных полирибосом, где и происходит их синтез. Методом иммунопреципитации пептидов удалось определить размеры этих полирибосом — 350S. Эта величина свидетельствует о том, что вирусные мРНК транслируются на полирибосомах, состоящих из 12 монорибосом. На полирибосомах такого размера могут транслироваться мРНК с молекулярной массой…

Продолжая эти исследования, Pawson и соавт. (1977) установили, что в бесклеточной белоксинтезирующей системе (использовали либо асцитные, либо клетки L) белок, синтезируемый геномной 30 — 40S-PHK RSV, имел молекулярную массу 76 000 и осаждался антисывороткой к разрушенному вирусу и р12, р30, но не антисывороткой к gp85. Смотрите — Трансляция РНК онкорнавирусов in vivo Следовательно, Рr76 является…

В клетках, зараженных R — MuLV, идентифицировано несколько быстрометящихся нестабильных высокомолекулярных белков: Prla±b (с массой около 200 000) — предшественник р30, р15, р12, р 10 и обратной транскриптазы; Prla±b (с массой около 90 000) — предшественник gp69/71, p 15(Е) и р12(Е); Рr3 (с массой около 80 000) и Рг4 (с массой около 70 000) —…