29 января 2014

Люминесцентный анализ состояния митохондрий в живой клетке

Следующий уровень сложности модели — митохондрии в составе живой клетки. Тестирование состояния митохондрий в клетке может производиться методами флуоресцентного анализа, технологически хорошо совместимого с автоматизированной системой классификации. Митохондрии обладают собственной флуоресценцией, обусловленной остатками ароматических аминокислот в составе белков митохондрий, а также флавиновыми и пиридиновыми компонентами в их дыхательной цепи (Barenboim et al., 1969; Черногрядская и др., 1978). Для оценки функционального состояния митохондрий оказалось также очень полезным использовать флуоресцентные зонды — ХС, флуоресценция которых зависит от состояния митохондрий, с которыми они связываются слабыми невалентными взаимодействиями.

Тестовая система клетка — митохондриальный флуоресцентный зонд была разработана Г. И. Морозовой под руководством Г. Е. Добрецова и Г. М. Баренбойма и описана в ряде публикаций (Морозова и др., 1982а, б; Морозова, 1984). В основе этой тест-системы лежит использование двух флуоресцентных зондов: широко известного 1,8-анилинонафталинсульфоната (АНС) и оригинального зонда n-толуолсульфоната 4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния (ДСМ). Структуры этих зондов и некоторых ксенобиотиков, упоминаемых в этом разделе, изображены на рис. Сродство этих зондов к определенным структурам определяется их амфифильностью (способностью распределяться между водной и мембранной фазами в измеряемой пропорции) и зарядом. Оба этих зонда образуют как бы анионно-катионную пару, что обеспечивает их высокую совокупную чувствительность к изменению зарядов определенных субклеточных структур, а также позволяет различать изменение электрических характеристик клеточных мембран и изменения конформации самих мембран между цитоплазматической и митохондриальной мембранами (Морозова, 1984). Спектры флуоресценции зондов АНС и ДСМ показаны на рисунке ниже.


Структурные формулы зондов АНС, ДМС и некоторых заряженных ксенобиотиков

Структурные формулы зондов АНС, ДМС и некоторых заряженных ксенобиотиков


Весьма существенным для данного метода является полихроматичность флуоресценции зонда ДСМ в живых клетках: в мембранах — свечение зеленое, в цитозоле — слабокрасное, в ядре — красное, в митохондриях, имеющих потенциал на мембране,— ярко-оранжевое (ярко-желтое), а в отсутствии потенциала — зеленое.


Нормированные спектры флуоресценции ДСМ (а) и АНС (б) в суспензии лимфоцитов (1) и в воде (2)

Нормированные спектры флуоресценции ДСМ (а) и АНС (б) в суспензии лимфоцитов (1) и в воде (2)

Fmах — интенсивность флуоресценции (F) в максимуме спектра; возбуждение флуоресценции ДСМ и АНС при 450 и 370 нм соответственно. Концентрация ДСМ — 10 мкМ, АНС — 40 мкМ; концентрация клеток 2*106мл-1. Зонд АНС в воде люминесцирует с очень низким квантовым выходом.


В соответствии с хемоосмотической концепцией П. Митчелла синтез АТФ из АДФ и фосфата в митохондриях аэробных клеток и в мембранах аэробных бактерий зависит от наличия на этих мембранах трансмембранной разности потенциалов. Известно, что проникающие ионы и заряженные красители распределяются по обе стороны модельных или биологических мембран в соответствии с величиной этой разности потенциалов на мембранах. Снижение ее в митохондриях клеток, вызванное какими-либо изменениями в их функциональном состоянии, например экзогенными факторами, приводит к перераспределению заряженных красителей между органеллами и средой. Такая же закономерность была обнаружена для заряженных зондов ДСМ и АНС. Эксперимент показал, что катионный зонд ДСМ интенсивно флуоресцирует в митохондриях аэробных клеток, в то время как анионный зонд АНС дает очень слабую флуоресценцию в них. Характер флуоресценции этих зондов в живых клетках резко меняется при изменении энергетического состояния митохондрий.


«Биологически активные вещества»,
Г.М.Баренбойм, А.Г.Маленков



Моделирование состояний — задача, которую для большинства случаев еще предстоит решать. Только АСК ХС обладает достаточной производительностью, чтобы установить характер и степень адекватности состояний модели in vitro и состояний in vivo в отношении большого массива ХС. Поэтому мы вынуждены ограничиться пока лишь кратким упоминанием основных способов создания моделей состояний. Первый способ состоит в том, что…

2- й пример. Пусть энергетика клетки является той системой, которую требуется представить параметрически. Набор состояний порожден в ходе морфогенетических процессов (нормальных и патологических) на основе, например, ткани печени. Самой экономной (а именно к наиболее экономному, но полному представлению всегда и следует стремиться) системой параметров будет в этом случае, вероятно, следующая: отношение активности суммарной гексокиназы к…

Рассмотрим на примерах, как можно определить систему представительных характеристик и параметров для спектра состояний и моделировать эти состояния: 1-й пример. Пусть межклеточный контакт является той биофизической системой, которую надо описать параметрически. Пусть объектами являются эпителиальные ткани лабораторных животных (или человека) во всем их разнообразии, порождаемом морфогенетическими, физиологическими и генетико-популяционными процессами. В качестве основной характеристики межклеточного…

Активность этого фермента существенно детерминируется генетически. В распределении популяции людей по активности этого фермента существуют два максимума, соответствующие низкой и высокой активности фермента; это можно рассматривать как отражение «генетически определенных состояний». Определив у ХС способность образовывать комплексы с медью, можно предсказать опасность того, что при длительном употреблении этот препарат может вызвать лекарственную волчанку у лиц…

Учет всех подобных особенностей реакций организма на ХС с определенным видом активности в зависимости от состояния, даже в форме вероятностного предсказания, имеет очень большое практическое значение. Такое предсказание может сделать гораздо более содержательными и одновременно дешевыми последующие испытания на животных, более безопасными клинические испытания и дальнейшее клиническое использование. Вместе с тем очевидно, что в общем…